【拔丝学堂 023】合成生物学和iGEM

拔丝小蚂蚁

【拔丝学堂 023】合成生物学和iGEM

北大84级微信群的周末讲座第23期，是由生物系的宋青给大家分享合成生物学的现状和未来。

首先感谢韩利民和罗新同学的邀请，有机会在这里和大家分享和共同学习合成生物学。这里的图片和文字都来自网络，由于没有在图片中标注原作者，所以不能公开发表，只能作为私人资料，仅供内部分享和交流使用，
作为生物学研究的新兴交叉学科，合成生物学，已成为生命科学领域的新星。合成生物学是利用数学，物理和计算机等学科的工程学理论应用至生物化学研究领域。合成生物学试图设计、构建和完善人工生物模块、系统，实现对复杂生物系统的测量和调控，在众多领域具有极好的应用前景。
这些领域包括更有效的疫苗的生产，研发和生产药物，以生物系统为基础的制造，还有开发可持续的能源，环境污染的生物治理，检测毒性物质等等。通过合成生物学的研究，人类也可以更深入的了解自然和自信，修复被破坏的生态系统，抵御外来入侵，呵护人类赖以生存和发展的地球。



这张照片左上图是六角蝾螈，是目前已经发现拥有巨大基因的生物之一，是人类基因组的10倍，个体的成熟器官具备强大的再生能力。右上图是扭在一起的餐叉和餐勺，代表科幻电影Matrix里的人类意念实验。我选用这两幅图片示意自然之神奇与人类梦想。

我简单介绍一下我的学习工作经历。我84年入学北京大学植物学专业，后转学生物化学。本科毕业后赴美国芝加哥大学攻读生物化学与分子生物学博士学位，师从华裔教授廖述宗，研究胆固醇代谢调节的分子机理。获得博士学位后受聘于美国葛兰素研究所从事药物研发。后返回芝加哥大学继续基础研究。2005年我回到中国，在北京科技大学执教至今，讲授《基因工程》等本科生和研究生课程。我接触合成生物学领域是2010年的iGEM，至今已组织本科生和研究生多次参赛。
下面这幅图来自2018年iGEM竞赛年鉴，是对300多支竞赛团队文案的词频统计数据，词的大小与词频成正比。这幅示意图直观表达出作为合成生物学的前沿教学阵地--iGEM的全景：系统研究生命现象，是合成生物学追求的主要目标；现阶段，微生物，而不是人类本身，是主要研究对象。




iGEM,英文全称为International Genetically Engineered Machine Competition，即国际遗传工程机器竞赛，由麻省理工学院于2003年创办，2005年发展成为国际性学术竞赛，是合成生物学领域的最高国际性学术竞赛。合成生物学是近年来新兴研究领域，受到了学术界和工业界的广泛关注。国际遗传工程机器竞赛(iGEM)涉及生物学、计算机科学、数学、艺术设计等多学科，是以合成生物学为核心多学科交叉国际级科技竞赛，其理念在于鼓励大学生积极创新，用创新去改变世界。
2019年，来自40个国家的三百多支竞赛团队参加了iGEM，其中北美，西欧占四成，中国，日本为主的东亚占四成，大约近万人，以本科生为主，也有高中生和研究生参加竞赛实验。自2003年至2019年，累计有五万多师生参加过iGEM， 目前已成为合成生物学领域的研究主力军。



我们通过2006年iGEM竞赛网站了解iGEM的初衷：“iGEM运动试图回答一个科学问题: 简单的生物系统能否由标准的、可互换的部件组成，并在活细胞中运行？ 是否生物体太复杂了，不能用这种标准方法改造？ 当然唯一能提供答案的办法就是尝试设计生物装置。iGEM 竞赛通过为学生提供一个标准化零件库(我们称之为生物积木) ，并要求他们用这些零件设计和制造基因机器来进行测试。 当然，也允许学生制造他们自己的生物积木。 关于生物积木的信息，以及制造和操作它们的工具箱，都是由标准生物零件的注册处提供的。 这是 iGEM 项目的核心资源（http://parts.igem.org/Main_Page)，为了满足项目的需要，这个项目正在迅速迭代发展。 除了试图回答上述问题，我们更广泛的目标还包括: 使生物系统工程能够促进工程生物学工具的公开和透明的发展，并帮助建设一个能够有效应用生物技术的社会，我们是否更接近于找到我们问题的答案？ 在短短三年时间里，iGEM 团队成功地部分或全部构建了各种系统，从生物传感器到生物感光胶片，所以看起来工程生物学是可能的。”



下图是2004年五所美国大学开启iGEM运动。右方列表是历年iGEM竞赛团队项目的档案网站。









上面三张幻灯片主要讲了iGEM的发展史，前面一张是iGEM founders和他们的初始团队，后面两张是合成生物学的一个发展简史。



那么上面这张幻灯片呢，实际上是用有机化学的一个发展史来。映射未来合成生物学的一个发展的可能性。

19世纪中叶，化学家们不再简单地分析现有的分子，而是开始合成它们，包括自然界中不存在的分子。 这种新的合成方法与更传统的分析方法相结合，彻底改变了化学，导致了对化学结构和反应基本原理的深刻理解，以及现代制药和化学工业的出现。 合成化学的历史为合成生物学的发展和影响提供了可能的路线图，合成生物学是一个新兴的领域，其目标是建立新的生物系统。
19世纪初，一个关键性的早期进展是精确地测量和分析化合物。 例如，通过收集和精确称量有机分子燃烧时形成的二氧化碳和水，就有可能确定这些分子的原子组成，以及它们的分子式。 这种仔细的分析带来了异构体的发现。令人震惊的发现是物理和化学性质非常不同的化合物可能具有相同的分子式。 新兴的合成化学领域，伴随着许多新的反应和分子，提供了一个有助于发展现代化学结构和反应理论的补充信息体系。 直到19世纪中叶，在小有机化合物的合成已经成为常规之后，化学家们才开始建立模型来解释原子之间的成键问题。 1852年，科学家提出，每个原子都有能力与一定数量的其他原子结合。 1858年，利用这个“价理论”提出了许多简单有机分子的结构，在19世纪60年代，这些结构式可以解释大多数异构体。 认为原子是固定排列的这一观点是一个关键的进步。
1865年 Kekul 提出了苯的结构式。 虽然 Berthlot 在19世纪50年代已经合成了苯，但是直到 Kekul 构想出环状结构，苯的稳定性才能得到充分的解释。分析方法和合成方法的结合似乎在现代生物学中重演。
从历史上看，生物学一直是一个几乎完全基于观察和分析的领域，目前它在测量准确性和数据量方面正经历着指数增长。 现代实验技术如基因组测序、 DNA微阵列、分子结构测定、高通量显微镜和体内生物传感器等等，代表了主要的分析进展，为我们提供了生物系统及其行为的描述，包括几乎所有蛋白质组的丰度、亚细胞定位和相互作用。 这些发展类似于十九世纪早期分析化学的进步。
然而，有机化学的历史表明，为了使生物学家真正了解复杂生命系统的机理，合成将是分析的必要补充。 结构重构不仅使我们能够确定什么是必要的，而且还能够确定什么是充分的来构建一个执行特定功能的系统。 建立和系统地修改生物体的能力将允许科学家以更深入的方式探索他们的设计原则，甚至合成生物学会对现存被进化历史约束而未出现的生命系统进行测试，以完善设计原理和制造方法。
早年合成生物学是作为一门生物物理学科创立的，它试图从化学和物理的第一性原理出发寻求对生命起源的解释。 现代合成生物学又被重复定义为一门工程学科，用于设计新的有机体，以及更好地理解基础生命机制。 虽然工程生物系统已被用于信息处理、建造材料、处理化学品、生产能源、提供食物，以及帮助维护或加强人类健康和我们的环境，然而合成生物学的变革性应用仍处于初级阶段，成功在很大程度上仍局限于实验室。



合成生物学是利用基因操作对细胞和细胞系统进行合理设计和工程的学科。它分为三个研究方法 : 基于DNA 的设备构建(插入细胞生产功能性的生物成分) ，研究原始合成细胞发育(构建活细胞的基本表征) ，以及基因组驱动的细胞工程。



向自然学习是人类获得新知识的主要途径。从天然遗传物质核酸DNA结构出发，有机化学家合成出类核酸结构，旨在开发能够在体外复制并最终在模拟细胞生物体中复制的人工遗传聚合物(也称为类核酸或 XNA)，可以储存基因信息，并对外界刺激作出反应进化。类核酸可以通过染色体中存储遗传信息来保护合成生物。 XNA 聚合物在疾病诊断和治疗中有着实际的应用。通过生物学家的整合，还可以在地球上制造”外星“生物体。科幻一下， 这些人造外星生命的设计和制造离不开人类的计算机和三维打印机。未来在人类殖民火星的过程中，可以想象通过光速传输生命蓝图，在火星上随时打印出生命体。合成生物学的发展对系统生物学会产生颠覆性作用，就像系统生物学对传统生物学的影响。




曾经有一位博士生花费几年时间寻找果蝇中的一个蛋白结构，后来在Craig Venter的计算机上化了几分钟就搞定了。在合成生物学的底盘细胞制造过程中，系统生物学会获得基因功能的准确和完整的理解。

下面这张图的右上图中显示人类基因组是六角蝾螈的十分之一。六角蝾螈是大自然的杰作，受到人类的强烈嫉妒，也许未来会有合成科学家去尝试获得超能力（笑话）。



当然这些“疯狂”的科学实验不会对自然生态系统产生多少影响，因为获得的性状不会稳定遗传，不会进入自然生态系统的“硬盘”。包括目前大行其道的转基因作物，都不会污染自然生态，因为这些品种的种子受控，必要时能够迅速绝种，从而可逆恢复原自然状态。明代中国引入玉米的种植后，人口迅速成为世界的三分之一，可见颠覆性粮食生产的社会影响力。现在中国在2020年能够实现四个现代化，转基因作物也是功不可没。未来百亿人的小康社会，合成生物学的贡献不可小觑。



细胞膜结构的空间分区对细胞生长极为重要。 为了创建人工细胞系统，基因信息和膜结构的生产需要耦合。 然而，天然的生化反应网络和膜结构在体外实施起来非常困难。 在这里，科学家利用双亲性弹性蛋白样肽(ELP)创建自组装约200纳米直径的空泡状结构。 为了从遗传学上对这些囊泡的生长进行编码，将无细胞转录翻译系统与DNA 模板一起封装在肽囊泡内。 此外，我们实现了膜肽本身的原位表达，并最终证明了囊泡的自主生长。



下图是一株支原体（M. genitalium JCVI-1.0）的基因组示意图，是通过人类化学合成而构建的生命体。基因组有58万多个碱基对组成，编码485个蛋白基因和43个RNA基因。这个人造细胞被贴上了遗传标签（水印），已区别天然物种。制造过程包括体外设计和制造核酸（蓝色方块），然后植入天然细胞并取代宿主核酸，宿主快速变形，完成物种转换。该实验证明新物种除了进化，也可以通过设计和嬗变产生。想像一下，未来生命也许能够以光速进行星际穿梭。当然地球也可能以类似的方式被外星生命入侵。所以现在所有的核酸合成仪都有过滤器，防患于未然。



Craig venter在演讲中介绍人造生命时指出，“我们在 核酸上加了水印，以区分合成生命和自然生命。 我的团队开发了一种新的编码，使我们能够用编码DNA的四个化学结构，来编写英文的全部字母。 在第一个人造细胞的例子中，我们列出了46位参与这个项目的科学家的名字。 我们还收录了三段名人名言，其中一段是詹姆斯 · 乔伊斯的名言‘生活，犯错，堕落，成功，从生活中重新创造生活’；另一个来自《美国普罗米修斯》奥本海默的传记: ‘看事物不是它们现在的样子，而是它们可能的模样’ 最后一句是 Richard Feynman 说的”我无法建造的东西，我无法理解”。我们还在遗传密码中加入了一个电子邮件地址，对于第一个拥有电脑作为父母的物种来说，这似乎是合适的”。



上图左面的黑板是加州理工的档案，显示Feynman原话“我无法创造的东西，我不能理解”。这个创造和神创论并不相同。无中生有( ex nihilo)为神独有。合成生物学只是借鸡下蛋。后来Craig Venter 回应可以修改DNA来纠正引用错误。在生物教学中时常出现进化论（Evolution)与智能设计(Intelligent Design)的辩论。从合成生物学角度出发，也许可以认为生命的可进化性是被设计出来的。神创论下的生命自然演化与进化，人类合成，或许都成为新生命发生的自然现象。

工程和改造合成微生物底盘是解开生命基本原理的最佳方法之一，而且会增强合成生物学在卫生、医药、农业、兽医和食品工业中的应用。构建微生物底盘的两种主要策略是自上而下的方法(基因组减小)和自下而上的方法(全基因组合成)。2001年在日本启动了“最小基因组工厂”(MGF)项目。 这个项目结果的最好例子之一是大肠杆菌 mgf-01，它的基因组减小，比亲本菌株具有更好的生长和更高的苏氨酸产生特性。 1998年至2002年在欧盟的第五个框架计划中实施“细胞工厂”项目，旨在全面了解微生物在应用领域中的应用。 这个项目的一个突出成果是阐明了枯草杆菌分泌的蛋白质。 最后GTL(基因组到生命)项目始于2002年的美国。 在这个项目中，研究人员的目标是在硅树脂和体外创造人工细胞。 合成微生物底盘在工程、改造和应用方面的研究方兴未艾，例如 Craig Venter 小组成功地设计和合成了一种最小的细菌基因组。




这张图显示科学家合成的一个新的人造细胞，jcvi-syn3.0(简称 syn3.0)，接近最小底盘细胞。它的基因组由53万个碱基对组成，473个基因编码438个蛋白质和35个 RNA。其中遗传物质复制需要34个基因，遗传物质的表达需要195个基因，细胞膜结构需要84个基因，代谢需要81个基因，还有79个基因未分类。473个基因中有179个基因的功能了解不全。


理解如何将生物功能编程为人造 DNA 序列仍然是合成基因组学的一个关键挑战。在这里，科学家报道了新月柄杆菌Caulobactere Thensis-2.0(c. eth-2.0)基因组的化学合成和测试。这是一个重写的细菌基因组，包含了细菌细胞最基本的功能。 科学家通过重写新月柄杆菌基因组的过程，在必需基因的层面上研究了基因功能。 在785,701碱基组成 的基因组里，用序列重写，把编码的基因从6,290减少到799。 总共引入了133,313个碱基替换，重写了123,562个密码子。 通过转座子突变检测了新基因组设计的生物学功能。



分析显示 Eth-2.0中432个必需基因在功能上与自然基因相同。 这些发现表明，改变 mRNA 结构和改变密码子上下文，似乎对合成基因组的生物学功能未产生显著影响。这个研究结果突出了化学合成重写基本基因组功能的前景，以及它在为工业目的和健康利益设计改良生物体方面的实用性。



左上示意图为大肠杆菌细胞内大分子的近似数目、形状和密度，小分子未显示。蛋白浓度每升体积高达300克，比血浆浓4倍，牛奶浓8倍。如今，应用计算机模拟生物过程是可能的。 几个研究小组使用性能和准确度不同的分子模型进行了这些计算。 在许多情况下，原子尺度的自由度被消除了，牺牲了结构的复杂性和化学的特异性来探索缓慢的过程。 从计算机模拟中，获得了关于宏观分子扩散，核体形成，以及细胞模拟空间内遗传物质的过程。 这些模型适用于细胞尺度和细胞周期长时间的生物过程模拟，包括非平衡事件，如蛋白质的共平移折叠、错误折叠和聚集。 这些具有挑战性的任务将依赖于实验和计算方法的集成，通过高效算法的应用来实现。
如何从多个分子之间相互作用中产生复杂的生物现象，是计算生物学需要解决的的主要难题。 下面两张示意图展现人类病原体生殖支原体（Mycoplasma genitalium)生命周期的全细胞计算模型，包括其所有分子组分及其相互作用。 该模型结合了多种数学综合建模方法，同时包含了不同尺度的细胞过程和实验测量。 我们的全细胞模型考虑了所有带注释的基因功能，并通过大量数据进行了验证。 该模型洞察到许多以前未被观察到的细胞行为，包括体内蛋白质-核酸耦连的速率。 此外，通过模型预测进行的实验分析识别了以前未被发现的动力学参数和生物学功能。



由于生物系统是模块化的，细胞可以通过以下方式建模: (1)将细胞划分为功能过程; (2)在短时间尺度上对每个过程进行独立建模; (3)在较长时间尺度上对过程子模型进行集成。 我们将生殖支原体分为28个功能过程，并利用不同的数学模型和不同的实验数据，在1 秒时间尺度上独立地模拟了每个过程。 子模型跨越了细胞生物学的六个领域: (1)转运和代谢，(2) 脱氧核酸复制和维持，(3) 核酸合成和成熟，(4)蛋白合成和成熟，(5)胞质分裂，(6)宿主相互作用。 子模型被分别实现。



嵌合抗原受体疗法（Chimeric antigen receptor therapy，简称CAR-T)最初是由 Zelig Eshharand 和他的同事在1989年提出的概念。简单地说，CAR主要由一种抗体的胞外单链可变片段(scfv)和胞内 T 细胞信号结构域组成。 这两部分与细胞外铰链和跨膜结构域相连接。 细胞外 scfv 区域识别肿瘤相关抗原(TAA) ，跨膜结构域将细胞外信号传递到细胞内，然后细胞内信号域将外部刺激转化为T细胞信号。 这种细胞结构使 T 细胞对肿瘤细胞产生特异性抗原反应。CAR的概念表明重定向 T细胞反应的可行性可以通过工程化设计的嵌体受体激活，当时没有完成临床验证。 2008年，Malcolm Brenner和他在休斯顿贝勒医学院的同事宣布， 基于神经母细胞瘤抗原设计的合成识别受体，通过病毒载体武装T淋巴细胞后，在临床上取得了第一次成功。 从那时起，利用这种新兴的方法取得了巨大的成就，其中不少证明了CAR相关癌症治疗的巨大潜力甚至临床疗效，CAR-T细胞治疗的研究也进入了快速发展时期。



合成生物学使一些新的医学应用方法成为可能，包括基于生物工程细胞的免疫疗法的开发，以及最重要的是利用肿瘤靶向受体-转基因细胞工程（CAR-T)。 CAR-T疗法已经成功地治疗了诸如B细胞淋巴瘤之类的血液肿瘤，并且有望为固体肿瘤提供新的治疗方案。可以促进 T淋巴细胞的重新编程，增强其在抑制肿瘤微环境中的生存能力和功能活性，或者挑战诸如感染、自身免疫和慢性炎症等疾病。 应用最新的生物工程方法，以增加控制T细胞活性的安全性和免疫调节胞外微环境，增强免疫应答反应。 下图示意CAR-T临床疗法，从病人的外周血分离出T细胞，在体外用病毒侵染后扩增，表达人造识别癌症蛋白的嵌合受体，再输入病人体内攻击癌细胞。嵌合受体的四个组成部分执行不同的生物功能。下图是迭代发展出的可控性更强的受体设计。





最后，我就想结合上次庄晓曦教授等几位同学们讲的神经生物学，来看一下我们合成生物学在这个领域的应用。



那么上图看到的是8万个神经细胞的电生理活动被记录下来的一个壮观的实验记录。这个技术手段也是来自于合成生物学的一个重要的贡献。



这位科学家是钱学森的侄子叫钱永健，他是2008年诺贝尔奖化学奖的获得者之一。他是一个非常优秀的化学家和生物学家。他发现了很多荧光蛋白的发光的机理发色团的一个自催化的合成过程。



他在合成生物学上的贡献呢，是上面这张幻灯片，就是把自然界原有的比较简单的绿色呀，红色呀，这些荧光蛋白，开发成了赤橙黄绿青蓝紫这个全波长的一个可见的荧光蛋白的一系列。

那么下面的我就再放几张用这个技术做了一些实验数据的一些图片，作为今天的这个汇报的一个结束啊。